2020细胞生物学教案.doc
<p>1第一章 绪论第一节 细胞生物学研究的内容与现状一、细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科细胞生物学：是在显微、亚显微与分子水平等不同层次上研究细胞结构、功能及生命活动规律的科学。细胞生物学研究的对象是细胞。细胞分子生物学是当前细胞生物学发展的主要方向。细胞生物学研究的主要内容是 细胞的形态与结构、代谢与调控、增殖分化、遗传变异、衰老与死亡、起源与进化、兴奋与运动以及细胞的传递等。 细胞生物学不同于细胞学主要表现在：第一，深刻性。它从细胞整体结构，超微结构和分子结构对细胞进行剖析，并把细胞生命活动同分子水平和超分子水平联系起来。第二，综合性。这所研究的内容广泛涉及到许多学科领域，同生理学、遗传学、生物化学、发育生物学等融合到一起。二、细胞生物学的主要研究内容大致可分为以下几个方面：(一)细胞核、染色体以及基因表达的研究 (二)生物膜与细胞器的研究(三)细胞骨架体系的研究(四)细胞增殖及其调控（五)细胞分化及其调控(六)细胞的衰 老与程序死亡(七)细胞的起源进化(八)细胞工程三、当前细胞生物学研究的总体趋势与重点领域（一）当前细胞生物学研究中的三大基本问题1、细胞内的基因组是如何在时间与空间上有序表达的？2、基因表达的产物如何逐级装配成基本结构体系及各种细胞器？3、基因表达的产物如何调节细胞最重要的生命活动过程的？（二）当前细胞基本生命活动研究的若干重大课题1、染色体DNA与蛋白质相互作用关系主要是非组蛋白对基因组的作用。2、细胞增殖、分化、凋亡（程序性死亡）的相互关系及调控3、细胞信号传导的研究4、细胞结构体系的装配第二节细胞学与细胞生物学发展简史一、细胞的发现英国学者胡克于1665年制造了第一台有科研价值的显微镜，第一次描述了植物细胞的构造，细胞的发现是在1665年。16771683年，荷兰人列文胡克用自己设计好的显微镜第一次观察到活细胞。二、细胞学说的建立及其意义2建立：18381839年德国植物学家施莱登和动物学家施旺提出：一切植物、动物都是由细胞组成的，细胞是一切动植物的基本单位，这就是著名的“细胞学说”。第二章 细胞基本知识概要第一节 细胞的基本概念一、细胞是生命活动的基本单位细胞是有膜包围的能进行独立繁殖的最小原生质团，简单地说细胞是生命活动的基本单位。可以从以下角度去理解：细胞是构成有机体的基本单位；细胞具有独立完整的代谢体系 ，是代谢与功能的基本单位；细胞是有机体生长与发育的基础；细胞具有遗传的全能性 ，即具有一套基因组(基因组是指一种生物的基本染色体套即单个配子内所含有的全部基因 ，在原核生物中即是一个连锁群中所含的全部遗传信息)。没有细胞就没有完整的生命。二、细胞概念的思考三、细胞的基本共性组成细胞的基本化学元素是相同的，并由这些元素构成无机与有机化合物。生物膜体系与遗传信息的复制与表达体系是构建细胞所必需的。细胞的基本共性有：所有细胞都有细胞膜；所有细胞都有 DNA 与 RNA；细胞都有核糖体；细胞都以一分为二的方式分裂增殖。第二节 病毒一、病毒的基本知识病毒是由一个核酸分子(DNA 或 RNA)与蛋白质构成的非细胞形态的生命体。类病毒仅由一个有感染性的 RNA 构成。朊病毒仅由有感染性的蛋白质构成。病毒是完全的寄生物。根据核酸类型不同，病毒可分为 DNA 病毒与 RNA 病毒。依据宿主可分为动物病毒、植物病毒和噬菌体等。二、病毒在细胞内的增殖（复制）病毒在细胞内的增殖又叫复制。其复制过程大致可分为：1.侵染；2.脱去衣壳，早基因的复制与表达，晚基因的复制、结构蛋白质的合成；3.装配、成熟与释放。三、病毒与细胞在起源和进化中的关系病毒可能是细胞在特定条件下“扔出”的一个基因组，或者是具有复制与转录能力的mRNA。这些游离的基因组只有回到它们原来的细胞内环境中才能进行复制与转录。第三节 原核细胞与古核细胞种类繁多的细胞可以分为原核细胞与真核细胞两类大类。近年有些生物学家建议将生物划分原核生物、古核生物和真核生物三大界，将细胞相应分为三大类型：原核细胞、古核细胞与真核细胞。 原核细胞无典型的细胞核，其基本特点：遗传物质仅由一个裸露的环状DNA构成；细胞内没有分化出以膜为基础的细胞器与细胞核膜。原核细胞大约出现在35亿年前，包括支原体、衣原体、立克次体、细菌、放线菌及蓝藻(蓝细菌)等6类。 3一、支原体支原体是目前发现的最小、最简单的细胞，直径只有0.10.3µm,能在体外生长，也能寄生在细胞内。二、原核细胞的两个代表细菌和蓝藻（一）细菌细菌有3种形态：球菌、杆菌、螺旋菌。进化上，细菌又可分为原细菌（古细菌）与真细菌两类大类。1、 细菌细胞的核区与基因：一个环状的DNA分子盘绕在核区，没有或有极少的组蛋白，无明显的Feulgen正反应。DNA复制不受细胞分裂周期的限制，可以连续进行，且DNA 复制、RNA转录、蛋白质翻译可以同时进行,这是细菌乃至整个原核细胞器与真核细胞最显著的差异之一。2、细菌细胞的表面结构：主要指细胞膜、细胞壁及其特化结构(中膜体、荚膜、鞭毛等) 。细胞膜是细胞表面的重要结构。细胞膜的功能包括：选择性地物质运输；细菌细胞膜含有丰富的酶系，执行重要的代谢功能。中膜体由细胞膜内陷形成，可能起DNA复制的支点作用。细胞壁的共同成分是肽聚糖，革兰氏阳性菌与阴性菌细胞壁成分与结构差异明显。荚膜是某些细菌表面的特殊结构，是位于细胞壁表面的一层粘液物质。 鞭毛是某些细菌的运动器官，结构简单。3、细菌细胞的核糖体 核糖体的沉降系数为70S，由50S大亚单位和30S 亚单位组成。大亚单位含有 23S rRNA, 5S rRNA和30多种蛋白质，对红霉素与氯霉素敏感；小亚单位含有16S rRNA与20多种蛋白质，对四环素与链霉素敏感。4、细菌细胞核外DNA核外DNA：质粒。裸露的环状DNA，能自我复制，并可整合到核DNA中。5、细菌细胞的内生孢子又称芽孢，是对不良环境有强抵抗力的休眠体。内生孢子：细菌细胞内的重要物质(特别是DNA) ，积聚在细胞的一端，形成致密体，可度过恶劣环境。细菌的增殖为直接分裂。（二）蓝藻又称蓝细菌，是原核生物，又是最简单的自养植物类型之一。蓝藻含有丰富的色素，可进行类似高等植物的光合作用。中央相当于细菌的核区；光合作用片层由藻胆蛋白构成，将光能传递给叶绿素a；细胞质内含物有的是储存的养料，有的功能不详；细胞膜外有细胞壁和胶质层4(鞘)。三、原核细胞与真核细胞的比较原核细胞与真核细胞的根本区别：细胞膜系统的分化演变；遗传信息量与遗传装置的扩增与复杂化。由于上述的根本差异，真核细胞的体积也相应扩增，细胞内部出现精密的网架结构细胞骨架。二者的区别可分为两部分进行比较：结构与功能比较：真核细胞的生物膜将细胞分化为核与质两部分，细胞质又分化出各种细胞器，细胞骨架又保证了细胞形态的合理排布与执行功能的有序性(P 36 表2-2)。细胞遗传装置与基因表达方式的比较：核膜使扩增了的遗传信息与复杂的遗传装置相对独立，使基因表达的程序有严格的阶段性与区域性(P 36表2-3 ) 。四、古核细胞（古细菌）古细菌（又称原细菌）是一些生长在极端特殊环境中（高温或高盐）的细菌。最早发现的是产甲烷细菌类。古核细胞的形态结构、遗传装置虽与原核细胞相似，但一些基本分子生物学特点又与真核细胞接近。现已有更多的论据说明真核生物可能起源于古核生物，论据如下：（1）古细菌的细胞壁成分与真核细胞一样；（2）古核细胞DNA中有重复序列的存在；（3）具有组蛋白；（4）古核细胞的核糖体与真细菌的差异很大，从对抗生素的反应看，应更类似真核细胞的核糖体；（5）根据对5SrRNA的分子进化分析和二级结构的研究，认为古细菌与真核生物同属一类。而真细菌却与之差别甚远。第四节 真核细胞的基本知识概要一、真核细胞的基本结构体系1、生物膜系统细胞表面是一种多功能结构；核膜又把细胞分为细胞质与细胞核。以生物膜系统为基础形成了各种细胞器。线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体及溶酶体等。2、遗传信息表达结构系统由 DNA蛋白质与 RNA蛋白质复合体形成的遗传信息载体与表达系统，一般以颗粒或纤维状的基础结构存在。包括染色质，核仁、核糖体等。3、细胞骨架系统细胞骨架由特异的结构蛋白质构成网架系统，可分为胞质骨架与核骨架。二、细胞大水及其分析细胞体积的守恒规律。三、细胞形态结构与功能的关系细胞的形态与功能具有相关性与一致性。四、植物细胞与动物细胞的比较5植物细胞特有的细胞器：细胞壁（主要成分是纤维素）、液泡、叶绿体等； 而动物细胞的中心粒在植物细胞中不常见到。第三章 细胞生物学研究方法第一节 细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜技术1、普通复式光学显微镜技术普通光学显微镜（最大分辨率为0.2µm ），主要由三部分组成： 光学放大系统，即目镜和物镜；照明系统；机械和支架系统。显微镜的性能优劣决定于它的分辨率。分辨率是指显微镜区分开相近两点的能力。2、荧光显微镜技术在紫外光显微镜基础上发展而来，利用样品自发荧光和诱发荧光，可以对某些生物大分子进行定性和定位研究。不仅可以观察固定切片标本，还可以在活体染色后对活细胞进行研究。3、激光共焦点扫描显微镜技术共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。它在某一瞬间只用一束通过检测器前的小孔的光成像，可显著提高分辨率。可以观察较厚样品的内部结构。 4、相差显微镜技术和微分干涉显微镜技术光线在通过密度不同的介质时，其滞留程度不同，即产生了光程差和相位差。相差显微镜的基本原理把光程差变成振幅差(即明暗) 。从而提高样品反差，故样品不需染色，适合观察活细胞。甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。它在结构上与普通显微镜最大的不同是在物镜后装有相差板。微分干涉显微镜用的是偏振光，增加了样品反差，并具有立体感，可作于研究活体细胞中较大的细胞器。录像增差显微镜技术在一定程度上可以填补光镜与电镜之间分辨率上的间隙。二、电子显微镜技术（一）电子显微镜基本知识分辨率最终决定于光的波长，由于使用电子束作光源，电镜的分辨率大大提高。电镜的分辨率常是超薄切片厚度的1/10 ，它的分辨率可达0.2nm ，其放大倍数为10 6倍。电镜的基本构造包括：电子束照明系统 ；电磁透镜成像系统；真空系统；记录系统；电源系统。（P 52表3-1 ）（二）主要电镜制样技术介绍人样品制备技术的特殊要求：样品要薄；更好地保持样品的精细结构；样品具有一定的反差。主要的用于观察生物样品的电镜技术有：超薄切片技术；是观察细胞超微结构的基础。负染色技术；冷冻断裂和冷冻蚀刻电镜技术技术； 电镜三维重构技术；扫描电镜技术（SEM）是观察细胞表面形的有力工具。三、扫描隧道显微镜(STM)是一种探测微观世界物质表面形貌的仪器，在纳米生物学的研究领域具有独特的优越性。6STM的特点：具有原子尺度的高分辨本领；可在真空、大气、液体等条件下工作；非破坏性测量。 第二节 细胞组分的分析方法细胞成分分析和形态学观察相结合，可揭示生物大分子在细胞内的构建及功能。一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物利用多种方法使细胞崩解，形成细胞器和细胞组分的混合匀浆，再通过差速离心，即利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。差速离心与密度离心相结合可以达到精确的分离。细胞不同组分沉降率不同，主要依赖于它们的形状和大小，通常以沉降系数S来表示(沉降系数是指悬浮在密度较低的溶剂中的一种溶质大分子，在每单位离心场作用下的沉降速率)。二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂质等到的显色方法 原位成分分析常利用一些显色剂与所检物质的特殊基团特异性结合的特征，通过染色反应的部位和颜色的深浅来断某种物质在细胞内的分布与含量。福尔根(Feulgen)反应可特异显示DNA的存在部位。PAS反应可确定多糖的存在。 四氧化锇 可证明脂肪滴的存在。苏 丹 和苏丹 黑也常用于脂肪的鉴定。米伦反应及重氮反应等用来测定蛋白质。检测和定位酶的技术是基于细胞或组织切片与适宜底物共同孵育，通过一定方法使产物显示出来 。例如检测碱性磷酸酶的格莫瑞方法。三、特异蛋白质抗原的定位与定性免疫荧光和免疫电镜是最常用的细胞内蛋白质定位技术。1、免疫荧光技术免疫荧光技术就是将免疫学方法与荧光标记技术 相结合研究特异蛋白质抗原在细胞内分布的方法。2、免疫电镜技术免疫电镜技术使特异蛋白的定位与超 微结构结合起来，使抗原定位更准确。如蛋白分泌的研究胞内酶的研究；一些结构蛋白的研究。四、细胞内特异核酸的定位与定性1、原位杂交技术用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或细胞中的位置的方法。2、Southern技术（了解）蛋白样品经电泳后，与DNA探针进行吸附，与DNA有亲合作用的蛋白带被显示出来。 五、利用放射性标记技术 研究生物大分子在细胞内的合成动态 放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用，对样品中放射性标记物进行定性与定位测定。7放射自显影技术包括两个主要步骤：即同位素标记的大分子前体的掺入和细胞内同位素所在位置的显示。基本步骤为：掺入、制片、敷胶、曝光、显影、镜检。六、定量细胞化学分析技术1、显微分光光度测定技术根据细胞内某些物质对光谱吸收的原理，来测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。2、流式细胞仪可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量。第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养细胞培养就是将动植物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞或直接以单细胞 生物，给予必要的生长条件，让其在培养瓶中或培养基上继续生长与增殖。（一）动物细胞培养从机体取出立即培养的细胞叫原代细胞。适应在培养条件下持续传代培养的细胞为传代细胞。通过纯系化或选择法从原代培养细胞中分离出来的细胞群体叫细胞株，细胞分裂周期约限于5060次。从原代细胞或细胞株中获得的可无限传代的细胞叫细胞系。（二）植物细胞培养单倍体细胞培养。原生质体培养：去壁的植物细胞叫原生质体。可培养成植株或体细胞杂交植株。（三）非细胞体系在细胞生物学研究中的作用来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了正常生物学反应所需的物质（供能系统和酶反应体系等）组成的体系即为非细胞体系。二、细胞工程应用细胞生物学方法，按照预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传物质的技术以及发展这种技术的领域为细胞工程。细胞工程所使用的技术主要是细胞培养、细胞分化的定向诱导、细胞融合和显微注射等。（一）细胞融合与细胞杂交技术真核生物的体细胞经过培养，两个或多个细胞融合成一个双核 或多核细胞的过程叫细胞融合。动物细胞融合一般要用灭活的病毒(如仙台病毒) 或化学物质 (如聚乙二醇，即PEG)介导；植物细胞融合时，要用纤维素酶去掉纤维素壁。20世纪80年代又发明了电融合技术。细胞融合可以在基因型相同的细胞间进行，也可以在基因型不同的种内细胞间甚至种间细胞间进行。（二）单克隆抗体技术1975年英国学者Milestein等开创了将产生抗体的单个细胞同瘤细胞杂交的技术。8他们的设计是经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞(B淋巴细胞)与骨髓瘤细胞融合，融合的杂交瘤具有两种亲本细胞的特性既可分泌抗绵羊红细胞的抗体，又可无限增殖。学者们纷纷利用这一技术来制备针对不同抗原的高度纯一的单克隆抗体。单克隆抗体就是单个杂交瘤细胞增殖产生的克隆细胞群分泌的高度纯一的抗体。（三）细胞折合与显微操作技术细胞拆合就是把细胞核与质分离开后将不同来源的细胞质与细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。显微操作技术：即在显微镜下用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射的技术。第四章 细胞膜与细胞表面第一节 细胞膜与细胞表面特化结构 细胞膜又称质膜，是围绕在细胞最外层，由膜脂和膜蛋白构成。一、细胞膜的结构模型1925年Gorter等人提出质膜由双层脂分子构成。1935年Danielli和Davson 提出三夹板模型。1959年Robertson提出单位膜模型。1972年Singer和 Nicolson提出流动镶嵌模型。该模型主要强调膜的流动性；膜蛋白的分布不对称性；这是生物膜的基本特征。根据已有的实验结果，生物膜具有如下共同特征：膜的基本结构由脂双分子层镶嵌蛋白质构成，双层脂分子以疏水性尾部相对，极性头部朝向水相。蛋白质分子以不同的方式镶嵌在脂双分子层中或结合在其表面，其分布的不对称性和与脂分子的协同作用使生物膜具有各自的特性与功能。生物膜可看成是蛋白质在双层脂分子中的二维溶液。二、膜脂（一）成分膜脂主要包括磷脂、糖脂、胆固醇三种类型。1、磷脂：磷脂构成了膜脂的基本成分，分为甘油磷脂和鞘磷脂。由极性头部和两条疏水尾部组成，为双极性分子。2、糖脂：为鞘氨醇的衍生物。含17个糖残基。3、胆固醇和中性脂质：胆固醇主要存在于动物细胞，可调节膜的流动性、增加膜的稳定性及降低水溶性物质的通透性。某些细菌含有中性脂类。（二）膜脂的运动方式膜脂分子的热运动方式：1、侧向运动；2、自旋运动；3、尾部摆动；4、翻转运动。三、膜蛋白（一）类型膜蛋白可分为两类：膜周边蛋白和膜内在蛋白。外在膜蛋白为水溶性蛋白，分9布在膜表面，与膜结合较疏松，用温和的方法就可从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。内在蛋白多为跨膜蛋白，也有些插入脂双层中，与脂双层分子结合紧密。只有用去垢剂使膜崩解后才可分离出。（二）膜内在蛋白与膜脂结合的方式与膜结合的主要方式有3种。 内在膜蛋白跨膜结构域是与膜脂结合的主要部位。具体作用方式为：跨膜结构域含有20个左右的疏水氨基酸残基形成螺旋，其外部疏水侧链通过范德华力与脂双层分相互作用。某些螺旋的外侧是非极性链，内侧极性链，形成特异极性分子的跨膜通道。某些跨膜蛋白的跨膜结构域常常仅有1012个氨基酸残基形成 折叠结构。（三）去垢剂是分离与研究膜蛋白的常用试剂，可使细胞膜分解。去垢剂有离子型去垢剂(如SDS)和非离子去垢剂( Triton x100)。四、膜的流动性（一）膜脂的流动膜脂的流动性主要指脂分子的侧向运动。（二）膜蛋白的流动五、膜的不对称性（一）细胞膜各部分的名称（二）膜脂的不对称性是指膜脂分子在膜的脂双层中呈不均匀分布。糖脂的分布表现出完全不对称性。（三）膜蛋白的不对称性膜蛋白的不对称性是指每种膜蛋白分子在细胞膜上都具有明确的方向性。各种生物膜的特征及其生物学功能主要由膜蛋白来决定的。六、细胞膜的功能细胞质膜的主要功能：为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境；选择性的物质运输并伴随着能量的传递；细胞识别与信息传递；为多种酶提供结合位点；介导细胞与细胞、细胞与基质这间的连接；参与形成细胞表面特化结构。七、膜骨架与细胞表面的特化结构细胞表面的特化结构包括膜骨架、鞭毛、纤毛、变形足和微绒毛等，它们都是细胞质膜与膜内细胸骨架纤维形成的复合结构，分别于维持细胞的形态、细胞的运动、细胞与环境的物质交换等功能有关。（一）膜骨架膜骨架是指细胞质膜下与膜蛋白相连的由纤维蛋白组成的网架结构，它参与维持细胞质膜的形状并协助完成多种功能。红细胞的膜骨架成分主要包括：血影蛋白、肌动蛋白、锚蛋白、带4.1蛋白等。(二)红细胞质膜蛋白及膜骨架 膜骨架蛋白网络与细胞膜之间的连接主要通过锚蛋白。此外，带4.1蛋白还可以与血型糖蛋白或带3蛋白结合，起到与质膜连接的作用。10第二节 细胞连接细胞连接是多细胞有机体中相邻细胞之间通过质膜相互联系、协同作用的重要结构。主要有3种类型：一、封闭连接封闭连接的主要形式是紧密连接。紧密连接存在于上皮细胞之间，通过嵴线使相邻细胞质膜紧靠在一起，可阻止可溶性物质沿细胞间隙渗入体内。同时还起到膜蛋白的隔离作用。二、锚定连接锚定连接使相邻细胞的骨架系统或将细胞与基质相连形成一个坚挺有序的群体。（一）桥粒与半桥粒桥粒在细胞之间形成钮扣式的结构将相邻细胞铆接在一起，同时也是细胞内中间纤维的锚定位点。桥粒相邻细胞质膜的间隙约 30nm，在质膜的胞质面有一致密斑，中间纤维直接与其相连。相邻两细胞的致密斑由跨膜连接糖蛋白连接。（二）粘着带(中间连接)与粘着斑粘着带位于上皮细胞紧密连接的下方，相邻细胞间形成一个连续的带状结构。粘合带处相邻细胞质膜的间隙约 1520nm。与粘着带相连的是肌动蛋白纤维，在细胞中形成平行于质膜的可收缩的纤维束。粘着斑是肌动蛋白纤维与细胞外基质之间的连接方式。在粘着斑处，跨膜连接糖蛋白向外通过纤粘连蛋白与胞外基质结合，其胞内结构域则通过微丝结合蛋白与肌动蛋白纤维结合。粘着带及粘着斑均起细胞附着与支持作用。三、通讯连接（一）间隙连接间隙连接处相邻质膜间的间隙为 23nm。连接的基本单位是连接子。连接子由6 个相同或类似的跨膜蛋白亚单位环绕，形成直径约 1.5nm 的孔道。相邻细胞质膜上的两个连接子相对形成间隙连接单位。间隙连接在细胞间代谢耦联和细胞通讯中具有重要作用。（二）胞间连丝高等植物细胞之间通过胞间连丝相互连接，完成细胞间的通迅联络。（三）化学突触化学突触是存在于可兴奋细胞之间的细胞连接方式，它通过释放神经递质来传导神经冲动。四、细胞表面的粘着因子（了解）细胞与细胞之间的粘连是由特定的细胞粘着因子钙粘素等介导的，细胞之间的锚定连接也需要粘着因子钙粘素与整联蛋白等参与。粘着因子均为整合膜蛋白，在胞内与细胞骨架成分相连。多数要依赖Ca 2+或Mg2+才起作用，少数不需要Ca 2 。1、钙粘素同亲性依赖Ca 2+的细胞粘连糖蛋白，对胚胎发育中的细胞识别、迁移和组织分化以及成体组织器官构成具有主要作用。已发现几十种钙粘素，如E钙粘素、P钙粘素等。</p>
